1株苎麻生防内生细菌的分离鉴定及抑菌能力

材料与方法

1.1 内生细菌的分离和保存

2015年12月至2016年12月选取中国农业科学院麻类研究所培育的中苎1号苎麻新品种在湖南省益阳市沅江试验基地进行栽培，2016年6月上旬取头麻成熟期生长良好、无病害的健康植株样品，放入样品袋中带回实验室。将植物样品清洗干净放置于通风阴凉处，使其表面水分蒸发干燥，将苎麻进行根、茎、叶分离后立即进行内生菌的分离筛选。细菌培养采用营养琼脂 （nutrient agar，简称NA） 培养基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0～20.0 g，pH值为7.0～7.2，121 ℃高压灭菌15 min。根、茎、叶内生细菌的合适消毒药剂及消毒时间分别为2%次氯酸消毒2 min、0.1%硝酸消毒1 min、2%高锰酸消毒2 min。

在无菌操作下挑选出平板上形态、颜色、大小各异的菌落，单独置于LB培养基上划线培养，用封口胶带包好置于 30 ℃ 恒温培养箱中培养12～24 h，观察细菌生长情况，若依然有不同形态菌落，继续进行平板画线培养直到分离出单一的菌落。

1.2 供试病原菌和培养基

试验中供抗菌谱测定用植物病原菌包括苎麻白纹羽病病菌（Rosellinia necatrix）、黄瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumebrium Owen）、油茶炭疽病病菌（Colletotrichum camelliae Massee）。

真菌培养基采用马铃薯葡萄糖（potato dextrose agar，简称PDA）培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖（或蔗糖）20 g，琼脂15～20 g，pH值自然，121 ℃高压灭菌15 min。将实验室保存纯化的多种病原菌的菌饼（0.8 mm）放于PDA培养基平板中央，对照设置为空白PDA培养基;将接种好的培养基放在25 ℃恒温培养箱中，当病原菌菌丝长至1 cm左右，用灭菌的牙签蘸取培养2 d的内生细菌单菌落，分别在距离病原菌 2.5 cm 处4点等距离对称地点接，以只接种了植物病原菌的培养基为对照组，接完后用封口胶带将培养基封好，放入 30 ℃ 恒温培养箱中培养。

1.3 内生菌的拮抗作用鉴定

其中真菌性病原菌以PDA培养基进行对峙试验，测定抑菌圈直径。抑菌活性用抑菌圈直径（mm）表示，抑菌圈直 径= 透明圈直径-孔径（8 mm）。对照培养的病原菌的菌丝长满平皿，观察、拍照并统计有拮抗作用的平板，并测量抑菌圈的大小。

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.4 内生菌的生理生化性状测定

参考《常见细菌系统鉴定手册》[9]以及《伯杰氏细菌鉴定手册》[10]对苎麻叶内生菌Y9菌株的形态特征、生长曲线、生理生化指标进行鉴定。生长曲线测定以无菌的NA培养基为对照，于30 ℃、180 r/min振荡培养，分别于0、6、12、18、24、30、36、48、60、72 h取样，测量拮抗菌的D600 nm，绘制菌株生长曲线。

1.5 内生菌的16S rDNA基因序列测定及其分析

采用康為世纪细菌基因组提取试剂盒提取内生菌基因。PCR引物：25F（5′-AACTKAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3′），1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）;PCR反应体系：10.0 μL Mix，0.5 μL Taq酶，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1.0 μL模板DNA，用ddH2O补足25.0 μL。Mix包括Buffer、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶。

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共进行35个循环;循环结束后 72 ℃ 延伸5 min，12 ℃保温，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，最终测序结果在NCBI数据库中进行Blast同源性比对。

2 结果与分析

2.1 抑菌广谱性

由表1可知，苎麻内生细菌菌株Y9对苎麻白纹羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黄瓜枯萎病病菌均有很好的抑制效果（图1），其抑制率分别达到53.6%、42.1%、34.8%，其中对苎麻白纹羽病病菌的抑制效果最好。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 生长曲线鉴定与菌落形态特征 苎麻内生细菌Y9菌株的形态特征表征呈现圆形或不规则，表面有光泽，透明，没有隆起，边缘整齐，呈乳白色，没有气味，生长速度正常，具体见图2。细菌生长曲线是指利用少量的单细胞微生物接种到三角瓶中进行培养，在不同的时间点测定其D600 nm来描述细菌的生长代谢周期。苎麻内生细菌Y9菌株的生长曲线见图3，菌株Y9的生长周期为48 h，其中对数生长期在4～12 h之间。

2.2.2 生理生化特征测定结果 由表2可知，苎麻内生细菌Y9菌株的革兰氏染色呈阳性。能利用葡萄糖，接触酶、甲基红、VP测定、硝酸盐还原的测定结果均呈阳性，能产氨。吲哚乙酸、产硫化氢、柠檬酸利用、纤维素分解、解磷能力的测定结果均呈阴性。

2.2.4 进化树分析结果 根据Blast同源性比对结果，对菌株Y9作进化树分析。由图4可知，菌株Y9为芽孢杆菌属，结合其理化性质，参考《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步判定菌株Y9为蜡样芽孢杆菌。

3 结论与讨论

内生菌在不表现外在感染症状的健康植物组织内部生长，因此它的存在和作用一直以来容易被人们忽视。近年来研究表明，植物体内存在大量的对植物病原菌具有较好拮抗作用的内生菌。因此，从植物中分离内生菌和寻找具有良好生防效果的菌株备受关注[8]。内生菌是目前不可多得的天然微生物资源，它具有广阔的研究和开发空间，可用于活性物质生产、经济作物种植、环境保护、卫生保健等各个方面[5，11]。研究表明，植物内生菌能够生活于植物体内的各个组织中，还可以在植物体内长期定殖并传导，不容易受环境等各个方面的影响。内生细菌作为生防菌发挥作用时有许多制约因素，除内生细菌的生防机制和转运外，植物的栽培条件、栽培措施，自然环境，微生态环境，细菌的形态稳定性等都影响内生细菌发挥作用[12-13]。

本研究经过严格的表面消毒程序，从健康的苎麻叶组织中分离得到1株对苎麻白纹羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黄瓜枯萎病病菌有较强拮抗作用的内生细菌，通过对其形态学鉴定、生理生化特征测定，结合16S rDNA序列分析，初步鉴定为蜡样芽孢杆菌，为进一步开展其生防机制的研究提供了基础。目前主要应用的芽孢杆菌活菌制剂有蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等[14-15]。有研究表明，蜡样芽孢杆菌可以降解血红蛋白[16]，蜡样芽孢杆菌BC98-Ⅰ发酵液与其抑菌粗提物对黄瓜枯萎病具有良好的抑制作用，使孢子萌发率降低、菌丝生长异常，且抑菌特性稳定，对外界环境有很强的耐受性和适用性[17]。芽孢杆菌作为土壤和植物微生态优势种群之一，其抗逆性较强，同时能够产生多种生物活性物质，目前已在农作物病虫害生物防治中发挥了重要作用[18-20]。

本研究从苎麻上获得了1株对苎麻白纹羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黄瓜枯萎病病菌具有良好拮抗效果的内生细菌，抑制率分别达到53.6%、42.1%、34.8%。根据其生理生化特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》，结合16S rDNA测定结果，初步将该内生细菌鉴定为蜡样芽孢杆菌。该菌株具有一定的研发潜力，但其生物学特性、生防机制、发酵条件等还有待进一步研究。

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