糖心乐对糖尿病心肌病大鼠心肌酶及心肌转化生长因子β1的影响

[摘要] 目的 探讨糖心乐（TXL）对糖尿病心肌病大鼠心肌酶、心肌转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法 SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，8周后形成糖尿病心肌病模型，随机分为模型对照组、达美康对照组、TXT大、小剂量组，各组大鼠均为12只，另设正常SD大鼠10只作为正常对照组。达美康对照组、TXL大、小剂量组分别给予3 mg/mL达美康混悬液、2 g/mL TXL、1 g/mL TXL灌胃治疗，模型对照组给予生理盐水灌胃。治疗4周后处死，取血检测血糖、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH），切取心肌组织，免疫组化法检测TGF-β1表达情况。 结果 与模型对照组比较，TXL大剂量组血糖明显降低[（10.54±2.06）mmol/L比（23.16±5.74）mmol/L]，CK、LDH明显升高[（120.57±18.83）U/mg比（78.26±12.01）U/mg，（5052.06±418.64）U/mg比（3784.15±349.62）U/mg]；TGF-β1阳性染色颗粒的平均光密度（MOD）降低[（0.148±0.006）比（0.262±0.008）]；差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。 结论 TXL对糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，可减少心肌酶漏出，改善心肌能量代谢，同时降低心肌中TGF-β1的表达，减慢心肌组织纤维化进程，延缓和改善糖尿病心肌病的心肌损伤。

[关键词] 糖心乐；糖尿病心肌病；血糖；心肌酶；心肌转化生长因子β1

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0016-04

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCMP）是指糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者心肌细胞原发性损伤，引起广泛的结构异常，最终导致左心室肥厚、心肌收缩和（或）舒张功能障碍的一种疾病状态。糖心乐（TXL）遵循中医辨证与西医辨病相结合的治疗原则，在前人临床研究和经验方的基础上，以及在中药药理机制研究的前提下，组成的中药复方，它具有多环节、多层次、多靶点的整合调节优势。本研究应用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）造成持续高血糖状态诱导形成DCMP模型，观察TXL对糖尿病大鼠血糖、心肌酶和心肌转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄清洁级SD大鼠80只，雌雄各40只，体重范围在170～200 g，该批实验动物从第四军医大学实验动物中心处购买，合格证号：SCXK（军）2012-006。实验期间要求实验室定时通风，室温保持在18～22℃，相对湿度60%～80%，保持自然光照，常规饲料喂养，自由饮食、饮水。

1.2 药物

STZ由美国Sigma公司生产，100 mg/支，批号SL12136；所购药物达美康为陕西东盛（集团）有限公司生产，规格80 mg/片，批号P2012121214203231。TXL的制备：将绞股蓝、人参、生石膏、麦冬、田三七等中药材用水煎3次，每次30 min，将3次的过滤液统一收集蒸发为含生药浓度分别为2 g/mL和1 g/mL的两种汤剂。

1.3 试剂

葡萄糖（GLU）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体（一抗）、辣根过氧化酶标记的IgG（二抗）、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。0.1M 磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4）：称取8.5 g NaCl、4.4 g Na2HPO4·2H2O、0.3 g NaH2PO4·2H2O，加蒸馏水至1000 mL。

1.4仪器

FA1004N型电子天平、LKD-2188型超薄切片机、BS-800全自动生化分析仪。

1.5 方法

1.5.1 实验动物造模及分组 随机选取SD大鼠共10只，雌5只，雄5只，将此10只大鼠作为正常对照组，剩余70只大鼠禁食（不禁水）12 h后，用浓度为0.55% STZ以55 mg/kg剂量一次性腹腔注射，0.55% STZ用0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 4.4）配制而成。正常对照组腹腔内注射等体积枸橼酸盐缓冲液[1]。1周后测血糖，血糖大于13.8 mmol/L则为DM造模成功者[2]，剔除13只血糖小于13.8 mmol/L的大鼠，DM造模成功大鼠共57只。另外随机选取DM大鼠48只，雌雄各为24只，分为模型对照组、达美康对照组、TXL大剂量组和小剂量组，每组雌雄大鼠各6只，用常规饲料饲养，8周后形成DMCP模型大鼠[3]。

1.5.2 给药方法 DCMP大鼠模型形成后，TXL大剂量组用高浓度（2 g/mL）汤剂以高剂量（14 g/kg·d）灌胃；TXL小剂量组用低浓度（1 g/mL）汤剂以低剂量[7 g/（kg·d）]灌胃；达美康组用混悬液（浓度为3 mg/mL）灌胃[剂量为20 mg/（kg·d）]；每日1次，用药连续治疗4周。正常对照组和模型对照组同时均用生理盐水灌胃[剂量为6.5 g/（kg·d）]。

1.6 指标检测

1.6.1 血糖测定 分别于造模1、8周（治疗前）及12周（治疗后）禁食12 h，大鼠内眦静脉取血后采用葡萄糖氧化酶法测定血糖。

1.6.2 心肌CK、LDH测定 12周末麻醉处死动物，迅速打开胸腔取左心室的前壁心肌组织0.1 g，用4℃生理盐水稀释制成匀浆液，浓度为10%，快速离心留取上清液，用CK、LDH测定试剂盒检测其含量。

1.6.3 心肌TGF-β1测定 取大鼠左心室前壁心肌组织剩余部分，用10%福尔马林液保存固定12 h后，常规石蜡包埋，用组织切片机以厚度4 μm切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的玻片备用。采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法，按试剂盒说明进行操作。选用磷酸盐缓冲液替代一抗作为实验阴性对照，光镜下（400×）观察，心肌细胞内、外观察到棕黄色物质定为TGF-β1染色阳性。图像分析采用Image-Pro Plus软件，每份标本的测量要求随机选取5个视野，测量各组TGF-β1阳性染色颗粒的平均光密度值（mean optical density，MOD）。MOD越大，表示TGF-β1表达越强。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用LSD-t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物情况

整个实验过程中，共有5只大鼠死亡：其中模型对照组2只雄性和1只雌性死亡，TXL大剂量组1只雄性死亡，小剂量组1只雄性死亡，其他各组均未出现大鼠死亡。其原因可能是由于血糖过高所导致出现糖尿病酮症酸中毒、感染和其他并发症所致大鼠死亡。

2.2 TXL对DCMP大鼠血糖含量的影响

造模1、8、12周时，与正常对照组比较，模型对照组、达美康对照组、TXL大剂量组、TXL小剂量组血糖含量升高明显，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），说明各组大鼠一直处于高血糖状态。造模12周（治疗4周）时，与模型对照组比较，达美康对照组、TXL大剂量组和TXL小剂量组血糖含量也降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），说明达美康及TXL大、小剂量对糖尿病鼠均有降糖作用。与达美康对照组比较，TXL大剂量组血糖升高不明显，差异无统计学意义（P > 0.05），说明大剂量组降糖作用与达美康对照组相当，TXL小剂量组血糖升高明显，差异有高度统计学意义（P < 0.01），说明小剂量组降糖作用不及达美康对照组和TXL大剂量组。见表1。

2.3 TXL对DCMP大鼠心肌酶含量的影响

治疗4周后，与正常对照组比较，模型对照组、达美康对照组、TXL大剂量组、TXL小剂量组大鼠心肌CK、LDH含量均明显下降，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，达美康对照组和TXL大剂量组心肌CK、LDH含量升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），TXL小剂量组心肌中LDH含量上升，差异有统计学意义（P < 0.05），CK含量无明显变化 （P > 0.05）；与达美康对照组比较，TXL大剂量组心肌组织中CK、LDH降低，但差异均无统计学意义（P > 0.05），TXL小剂量组心肌CK、LDH均降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），说明TXL大剂量组升高心肌酶作用与达美康对照组相当，而TXL小剂量组升高心肌酶作用不及达美康和TXL大剂量组。见表2。

2.4 TXL对DCMP大鼠TGF-β1表达的影响

治疗4周后，与正常对照组比较，模型对照组、达美康对照组及TXL大、小剂量组TGF-β1表达升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，达美康对照组和TXL大剂量组TGF-β1表达均降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），TXL小剂量组TGF-β1表达有所降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）；与达美康对照组比较，TXL大剂量组TGF-β1表达升高，差异无统计学意义（P > 0.05），而TXL小剂量组TGF-β1表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05），说明TXL大剂量组降低TGF-β1表达的作用与达美康对照组相当，而TXL小剂量组降低TGF-β1表达的作用不及达美康对照组和TXL大剂量组。见表3。

3 讨论

本实验首先采用腹腔注射STZ损伤大鼠胰腺诱导糖尿病模型，给药途径选择腹腔注射法，损伤小，一次性注射后即可出现稳定高血糖状态，方法简单，选择大鼠作为造模动物，是因为大鼠胰腺B细胞对STZ作用，敏感性较强且稳定[4]，造模1周后即能出现高血糖状态，8周后进展形成为DCMP大鼠模型[3]。实验中经动态检测血糖显示造模各组大鼠一直处于糖尿病的高血糖状态，持续的高血糖，造成葡萄糖毒性影响心肌细胞线粒体功能，影响心肌组织的能量供应，使心肌细胞凋亡增加，最终导致心肌的收缩舒张功能障碍，形成DCMP。

多种酶参与到心肌组织能量的供应过程中，LDH可催化乳酸使其氧化为丙酮酸，因此能更有效地给心肌组织提供三磷酸腺苷（ATP）；CK可催化肌酸和ATP，使其生成磷酸肌酸，更有利于能量储备及利用。由于DCMP长期的高血糖引起的心肌细胞损伤，可引起心肌细胞内CK和LDH的外漏，导致心肌组织中二者消耗增加[5]，细胞能量代谢降低，能量供应和储备不足，致使心肌细胞左心室出现代偿性重塑和肥厚，具体则表现为收缩和舒张充盈功能的改变[6]。

实验结果表明TXL对糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，中药复方TXL制剂由人参、生石膏、麦冬、绞股蓝、田三七等[7]制成，该组方用药体现了中医辨证论治的长处，并且兼顾益气、清热、养阴、活血化瘀等观念。现代药理研究发现，人参可从多种途径发挥降糖作用，人参中含有人参总苷、人参多糖和人参多肽，这些物质均具有降血糖作用，血糖含量减低，使心肌中的糖原沉积量随之减少，最终达到对抗由高血糖状态所导致的心肌细胞损害。三七中含有的三七皂苷C1，可促使糖尿病小鼠肝糖原合成量增加，连续给药情况下，降糖效果随之增强[8]。麦冬中所含有的有效成分麦冬多糖也具有明显降血糖功效，它可以对抗因肾上腺素含量降低而引起的动物血糖升高[9]。绞股蓝中的四氧嘧啶对糖尿病小鼠也有明显的降血糖效果[10]。实验中TXL大剂量组大鼠的CK和LDH含量明显升高，其原因可能是由于TXL可减轻心肌细胞膜的损伤，稳定心肌细胞膜，有效减少CK与LDH等酶的漏出，纠正心肌细胞能量代谢障碍，增加心肌收缩和舒张能量的供应储备，保护心肌细胞，改善心脏的功能。

TGF-β1是一种多功能的细胞因子，对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要作用，主要调节细胞外基质的形成。TGF-β1表达增加可使许多细胞，如成纤维细胞等细胞合成胶原蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白等含量增加，加速相应胶原基因的表达[11]，同时它还能通过抑制蛋白酶合成、增加蛋白酶原激活抑制物来减少降解细胞外基质，在组织纤维化的发生和发展过程中起着重要作用。研究表明，TGF-β1在DM时表达增强，能刺激心脏成纤维细胞中的Ⅰ型和Ⅲ型胶原基因表达增加，下调胶原酶活性，从而达到减少胶原降解的作用[12-15]。

综上所述，本实验结果表明TXL可降低TGF-β1在DCMP大鼠心肌中的表达，表明TXL可减轻心肌组织纤维化，有助于延缓DCMP进程，可能是由于血糖降低本身，对TGF-β1的直接抑制作用，或是由于糖基化终末产物减缓刺激肾素-血管紧张素系统在DCMP中的活性，其机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2014-05-19 本文编辑：任 念）