血管内皮生长因子介导自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中的作用分析

材料

1.1 实验动物

SPF级3月龄雌性大鼠120只，体质量（300±50）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2017-0022，普通级，分12个笼子饲养，每个笼子10只。饲养于笔者所在医院动物中心实验室。

1.2 药物与试剂

胎牛血清购自美国Gibco公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司;磷酸缓冲液PBS购自天津科密欧有限公司;caspase-3、caspase-9抗体购于上海安研有限公司;LC3、Beclin-1抗体购自武汉华联科有限公司;VEGF-A、mTOR抗体购自默克有限公司;苯甲酸雌二醇注射液购自天津金耀氨基酸有限公司，国药准字H12020529，规格1 ml：1 mg;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）购自sigma公司。

1.3 仪器

全自动组织脱水机购自德国SLEE公司;低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司;光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司;电子天平购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司;流式细胞仪购自Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 建立模型

建立腰椎不稳定模型，切开大鼠胸部显露胸椎下段、腰椎和骶骨上段，使用消毒后的手术刀切除全部腰椎棘突、棘上韧带、棘间韧带金腰段和两侧腰椎关节突关节的后外1/2，缝合深筋膜和皮肤，不缝合竖脊肌，另外A组大鼠仅切开皮肤后即缝合，作为假手术对照。根据刘光源等[7]研究表明，雌性大鼠切除卵巢后会加速椎间盘的退变。使用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，注射剂量为40 mg/kg，后固定大鼠，在无菌条件下经腹侧入路切除双侧卵巢。

2.2 3-MA储存液的配制

利用1×无菌PBS溶解3-MA粉末，配制成15 mmol/L的储存液，避光并在-20 ℃保存。

2.3 分组及药物干预

将大鼠随机分为4组：A组为假手术组;B组行双侧卵巢切除手术组;C组为行双侧卵巢切除手术并注射雌激素组，术后每只小鼠肌肉注射0.5 ml的雌激素;D组双侧卵巢切除手术，术后肌内注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）2 μl/只。

2.4 检测项目

2.4.1 HE染色观察 使用石蜡切片后脱蜡至水，用苏木素染色液染色5 min，用水冲洗3次后使用95%乙醇分色5～10 s，使用伊红染色液染色1 min继续使用乙醇脱水后用二甲苯透明5 min后用中性树胶封片;在400倍光学显微镜下观察。

2.4.2 Western blot检测蛋白表达水平 按照Western blot检测方法操作，使用蛋白质条带用扫描仪进行扫描，以β-actin为内参，应用Imagaquent 5.1软件对VEGFA、p-mTOR、Beclin-1、LC3、Caspase-3和Caspase-9蛋白质条带灰度进行相对定量分析。以目的蛋白条带与β-actin灰度比值表示蛋白相对表达水平。实验重复3次，取平均值为最终结果。

2.5 统计学处理

本研究采用SPSS 20.0软件和GraphPda Prism 5软件对数据进行处理和分析作图，方差分析使用Analysis of variance，当组间差异有统计学意义时，进一步采用SNK方法进行比较;使用单因素方差分析（ANOVA）时，检验中P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异非常显著，本研究所有检验均为双侧检验。

3 结果

3.1 HE染色观察大鼠椎间盘髓核变化

由图1可以看出，control组大鼠髓核结构完整，且囊泡结构可完整可见;model组和3-MA组大鼠髓核组织脱水严重，其结构也被破坏，髓核退变明显，相比model组3-MA组大鼠更为严重;相比model组，estrogen组大鼠髓核组织较为完整，无明显被破坏和髓核退变出现。

3.2 大鼠血管内皮生长因子VEGF-A及相关信号通路p-mTOR蛋白组间比较

由图2可以看出，相比control组，model组和3-MA组大鼠VEGF-A和p-mTOR蛋白表达量显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;相比model组，estrogen组大鼠VEGF-A和p-mTOR蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

3.3 大鼠椎间盘组织的自噬水平组间比较

由图3可以看出，相比control组，model组和3-MA组大鼠Beclin-1和LC-3蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;相比model组，estrogen组大鼠Beclin-1和LC-3蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），相比model组，3-MA大鼠Beclin-1有一定程度升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

3.4 大鼠椎间盘组织凋亡情况组间比较

由图4可以看出，相比control组，model组和3-MA组大鼠Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;相比model组，estrogen组大鼠Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

由图5可以看出，control组大鼠椎间盘组织有较少的凋亡，相比control组，model组恒温3-MA组大鼠椎间盘组织凋亡显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;相比model组，estrogen组大鼠椎间盘组织凋亡显著减少，差异有统计学意义（P<0.01）。

4 讨论

自噬可以在一定程度上保护椎间盘细胞，在正常椎间盘细胞中自噬可以持续激活并保证椎间盘细胞在低血供时的能量供应[8]。正常程度的自噬可以清除细胞内损伤蛋白质和失去功能的细胞并维持细胞的正常功能和活力。目前尚无公认的可以完全模拟椎间盘退变的标准动物模型[9]，本实验使用物理方法制成腰椎不稳定模型，后切除卵巢后会加速椎间盘的退变[10]，造成大鼠椎间盘退变模型。李世平等[11]研究表明，人和大鼠的正常关节软骨中，自噬的标志性基因Beclin-l和LC3有明显表达。在严重退变的人和大鼠关节软骨中Beclin-l和LC3的表达显著减少。同时王月霞等[12]研究表明，自噬活性的降低可能是导致受损大分子物质的蓄积和细胞死亡，并最终引起关节和椎间盘退变。本实验中可以看出，相比假手术组，模型组大鼠体内自噬相关标志性基因Beclin-l和LC3有显著降低，表明椎间盘退变的大鼠体内自噬显著降低，这和Zheng等[2]研究得出的结论相一致。

椎间盘退变涉及到的相关信号通路较多，间盘组织中VEGF表达增加，一定程度上激活了mTOR信号通路，抑制了细胞自噬水平，使得椎间盘细胞凋亡，导致椎间盘退变的加速发生。有研究表明，椎间盘退变过程与新生小血管密切相关，组织学检查发现，椎间盘退变患者的纤维环前外侧部逐渐出现新生小动脉血管。吴宥熹等在研究心机细胞缺血时发现VEGF可以通过PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制细胞的自噬。目前研究发现，PI3K-AKT信号通路在细胞增殖、分化、代谢中发挥重要作用。人类和鼠类在mTOR结构的氨基酸分子水平上的同源性高达95%，使用大鼠的mTOR研究人类的mTOR信号通路有很大的可信度。相关研究表明，mTOR不仅有控制基因翻译、参与DNA/RA合成、影响蛋白质降解等mTOR信号通路不仅是细胞正常生长周期的调控中心，还是PI3K-AKT信号通路控制细胞自噬的关键调节点。mTOR信号通路在大鼠椎间盘软骨终板细胞体外自然退变过程中起到重要作用，软骨终板细胞传代过程中，mTOR信号通路主要负责加速、缓解甚至抑制大鼠椎间盘软骨终板细胞的生理性退变。本研究中可以看出，相比模型组，假手术组大鼠体内VEGF含量显著升高，且相关信号通路蛋白p-mTOR显著升高，说明VEGF含量升高可以介导激活mTOR信号通路促进mTOR磷酸化转化为p-mTOR，促进细胞的自噬，抑制椎间盘细胞凋亡、缓解椎间盘退變。

研究表明，自噬可以一定程度保护细胞，适度自噬可保护细胞;但过度自噬也会促进细胞死亡。研究发现，严重的退变椎间盘患者体内的自噬水平要明显低于正常椎间盘，而凋亡水平却显著升高。目前凋亡与椎间盘退变的关系已有较多的研究，在VEGF的介导下，椎间盘细胞的死亡受体途经、内质网应激与线粒体凋亡途径可以被激活，引起细胞凋亡。目前研究较多的控制凋亡的因子为Bcl-2家族和Caspase家族。Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子。相关研究通过前列腺腺癌细胞实验分析得出，Caspase-9基因处于Caspase家族激活基因的顶端，是Caspase家族中最常见的凋亡启动子，通过自身的裂解使得 proCaspase-3产生有活性的Caspase-3。这种有活性的Caspase-3是执行凋亡的基因，主要作用机理是通过剪切另外的Caspase底物引起级联反应，最终导致细胞凋亡。本研究中可以看出，相比假手术组，模型组大鼠体内的Caspase-3、Caspase-9含量显著升高，说明模型组大鼠体内细胞凋亡程度增加、自噬程度降低，使用雌激素抑制大鼠椎间盘退变组大鼠体内Caspase-3、Caspase-9含量显著降低说明该组大鼠体内细胞凋亡显著降低，细胞自噬显著升高，相关凋亡信号通路得到了促进。

綜上所述，血管内皮生长因子介导自噬相关通路在椎间盘退变大鼠中作用，其作用机制可能促进mTOR信号通路、降低细胞凋亡信号通路有关。VEGF的升高可以使得p-mTOR、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著降低、Beclin-1和LC3蛋白表达显著升高。但血管内皮生长因子介导自噬相关通路相对较复杂，然而本研究的自噬信号通路较少，在后续的实验中可以研究VEGF介导其他信号通路对椎间盘退变的保护机制。

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（收稿日期：2018-12-20）