STAT3基因与MMP-2、MMP-9在乳腺浸润性导管癌中的表达及其相互关系

[摘要] 目的 磷酸化信号传导与转录激活因子3蛋白与乳腺浸润性导管癌中上皮间质转化（EMT）关系密切，EMT需要降解细胞外基质（ECM），而基质金属蛋白酶（MMPs）是降解ECM和基底膜（BM）的主要执行者。本研究从EMT角度探讨磷酸化信号传导与转录激活因子3（STAT3）基因与MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义。方法 应用RT-PCR技术检测30例新鲜乳腺癌及癌旁组织标本的STAT3基因的表达，并以免疫组化方法检测70例乳腺浸润性导管癌组织中pSTAT3、MMP-2和MMP-9的表达，分析pSTAT3蛋白与MMP-2、MMP-9表达的关系及其与临床病理参数的关系。 结果 STAT3mRNA在乳腺癌标本中相对浓度为0.526±0.312，癌旁组织为0.197±0.161，两组间有显著统计学差异（P < 0.05）；pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺浸润性导管癌中阳性表达率分别为62.9%、72.8%、67.1%，明显高于正常乳腺组织19.2%、26.9%、34.6%，具有显著统计学差异（P 均< 0.05）。MMP-2、MMP-9在不同年龄、肿瘤大小、ER、PR表达组之间比较，差异无统计学意义，而在不同组织学分级、有无淋巴结转移之间，MMP-2、MMP-9表达有显著差异（P均<0.05）。 结论 STAT3基因及pSTAT3 与 MMP-2、MMP-9表达在乳腺癌中呈正相关，STAT3基因及pSTAT3和MMP-2 、MMP-9的高表达与乳腺癌的组织学分级与淋巴结转移相关，STAT3基因可能通过调节MMP-2、MMP-9的表达介导EMT从而促进乳腺浸润性导管癌的侵袭转移。

[关键词] 乳腺浸润性导管癌；信号传导与转录激活因子3；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；上皮间质转化；荧光定量PCR

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）29-0058-04

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在全球每年新发的120多万例乳腺癌患者中，约有20万死于乳腺癌的转移[1]。而上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的发生被认为是上皮来源的癌细胞发生局部浸润及远处转移的首要事件。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的复杂过程，在此过程中上皮细胞的极性消失、迁移和运动能力增强同时伴有上皮细胞标志物的丢失而间质细胞标志物的过度表达[2]。目前较为公认的调控EMT的关键性转录因子主要包括Snail、Smad相互作用蛋白（smad interactionprotein 1，SIP1）和Twist等，新近研究发现信号传导与转录激活因子3（signal transduction and activators of transcription 3，STAT3）信号活化也与肿瘤的EMT有关[3，4]。我们前期的研究也证实在浸润性乳腺导管癌中pSTAT3与EMT密切相关，活化的STAT3可能通过介导EMT促进乳腺浸润性导管癌的侵袭转移[5]。上皮间质转化需要降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解ECM和基底膜（basement membrane，BM）的主要执行者。我们设计通过检测STAT3基因及MMPs重要家族成员MMP-2，9蛋白的表达，旨在从EMT角度继续探讨STAT3基因与MMP-2，9蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义。

1材料与方法

1.1标本收集

收集温州市中西医结合医院与温州医学院附属第一医院2011年1～12月行乳腺根治术切除的有完整临床及病理资料的乳腺浸润性导管癌病例70例为研究组，26例癌旁正常组织为对照组。另取术中冰冻证实为乳腺浸润性导管癌的新鲜乳腺癌及癌旁组织30例，液氮冻存，备RT-PCR实验。

手术后尽快地收集组织标本，避免RNA降解。剔除肿瘤的坏死部分、肌肉及脂肪，确保取材的质量。在尽可能远离肿瘤的部位（>2 cm）取癌旁组织。先将标本置入冻存管于液氮中速冻，然后移入-80℃低温冰箱保存备用。

1.3总RNA的提取及逆转录为cDNA

标本在盛有液氮的研钵中碾碎后，按RNAeasy试剂盒说明提取总RNA。用紫外分光光度计和甲醛琼脂糖变性电泳对提取的总RNA进行纯度和含量鉴定。OD260/OD280值显示在1.8～2.0之间。用逆转录试剂盒将2 μg总RNA逆转为cDNA，以上步骤均按试剂盒说明操作。

1.4实时定量PCR检测

1.5免疫组织化学

所有标本经10％中性甲醛固定，石蜡包埋，以4 m厚度连续切片，常规脱蜡和水化后，免疫组织化学Envision二步法染色按试剂盒说明书操作步骤进行，DAB显色，苏木素复染，封片。阴性对照用PBS代替一抗，以已知阳性切片作为阳性对照。

免疫组化染色阳性结果判断：pSTAT3蛋白阳性表达定位在胞核，血管内皮细胞呈阳性表达，可作为内对照。pSTAT3阳性细胞数≥10％为阳性，<10％为阴性。MMP-2、MMP-9蛋白检测以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打分0，l，2，3分；着色面积按无着色、着色 2/3分别评0，l，2，3分。根据两项得分之和判断结果：<3分为阴性，≥3分为阳性。每张切片选择有代表性的区域，在100倍视野下进行计数，共计5个视野，取其平均值以避免随意性。

1.6统计学处理

2结果

2.1 STAT3mRNA在乳腺浸润性导管癌中的表达

2.2 pSTAT3、MMP-2和MMP-9蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达

3讨论

上皮间质转化（EMT）是近年细胞生物学领域的重大发现，由于其与胚胎形成、组织再生以及上皮细胞肿瘤恶性进展等方面均存在重要联系，因而EMT形成机制的相关研究正成为临床和基础研究领域十分活跃的课题，对于众多疾病的防治具有深远影响。发生EMT的上皮细胞在经历了短暂的结构改变后，极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，细胞的迁移和运动能力增强。EMT是目前上皮来源的恶性肿瘤发生侵袭转移的重要原因，已被证实是包括结直肠癌、肺癌等在内的多种恶性肿瘤进展的关键环节[6，7]。

细胞外基质由蛋白和多糖组成，分布于全身各组织，为细胞的生长、分化和组织的共存提供合适的环境。大量研究表明，ECM降解主要靠基质金属蛋白酶家族。它是一组锌离子依赖性内肽酶，几乎可以分解细胞外基质的各种成分，促进肿瘤侵袭转移[8，9]。恶性肿瘤中存在某种因素可使MMPs过度表达，导致基质降解，有利于肿瘤浸润转移。目前已发现的MMPs28种，较为重要的是MMP-2和MMP-9，其主要作用底物是包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶、弹性蛋白。李靖若等[10]报道在乳腺癌中MMP9的表达与淋巴结转移成正比。Li HC等[11]检测了270例腋淋巴结阴性乳腺癌中的MMP-2和MMP-9的表达，结果显示MMP-2表达与肿瘤大小和组织学分级正相关，MMP-9表达与组织学分级正相关。

STAT3是信号传导与转录激活因子家族的重要成员，己被公认为是一种癌基因或类癌基因。当细胞因子或生长因子等激活STAT3上游的Janus激酶（JAK）后，活化的JAK募集胞浆中以单体存在的STAT3分子，使与受体结合的STAT3分子酪氨酸磷酸化后（p-STAT3，Tyr705），STAT3形成同源或异源二聚体从受体上释放下来，进入细胞核调节靶基因转录[12]。STAT3信号活化通过调节E-钙黏素（E-cadherin）与波形蛋白（Vimentin）的表达介导肿瘤的EMT已有报道证实[3，4，13]，另有研究结果显示STAT3信号活化能通过诱导细胞外基质降解参与肿瘤的侵袭转移[14]。

本实验首先利用荧光定量RT-PCR方法检测一组30例乳腺癌组织和癌旁组织的STAT3 mRNA表达，结果发现STAT3基因的转录产物在乳腺癌标本中相对浓度为0.526±0.312，癌旁组织为（0.197±0.161），两组间有显著统计学差异（P < 0.05），表明STAT3 mRNA转录表达上调在乳腺癌的发生、发展过程中发挥重要作用。为了较大样本进一步分析STAT3在乳腺癌中的表达及其与MMPs的关系，我们以70例乳腺浸润性导管癌为研究组，26例癌旁正常组织为对照组进行pSTAT3、MMP-2和MMP-9的免疫组织化学染色。结果显示pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺癌组织中表达率分别为62.9%、72.8%、67.1%，明显高于正常乳腺组织，具有显著统计学差异。MMP-2、MMP-9在不同年龄、肿瘤大小、ER、PR表达组之间比较，差异无统计学意义，而在不同组织学分级、有无淋巴结转移之间，MMP-2、MMP-9表达有显著差异（P均< 0.05）。上述实验结果证实了pSTAT3、MMP-2、MMP-9参与了乳腺癌的浸润转移过程，与前述报道基本一致。

另外，对pSTAT3、MMP-2和MMP-9蛋白在乳腺癌组织中的相关性分析中，显示pSTAT3与MMP-2、MMP-9表达呈正相关，提示pSTAT3可能参与了MMP-2、MMP-9表达调节，通过诱导细胞外基质降解参与肿瘤的侵袭转移。有研究指出其机制可能是MMP-2、MMP-9作为STAT3下游靶基因，STAT3磷酸化后进行核转位，调控MMP-2、MMP-9基因的表达[15，16]。

综上所述，本次研究中发现，STAT3基因在乳腺浸润性导管癌中呈现高表达，其磷酸化蛋白（pSTAT3）与MMP-2、MMP-9跟乳腺癌的分化、转移密切相关。活化的STAT3可能通过调节MMPs的表达介导EMT，从而促进乳腺浸润性导管癌的侵袭转移。

[参考文献]

[1] Jemal A，Bray F，Center MM，et al． Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90．

[2] Polvak K， Weinberg RA. Transitions between epithelial and mesenchymal states：acquisition of mal1ignant and stem cell traits[J]. Nat Rev Cancer，2009，9（4）：265-273.

[3] Colomiere M. Ward AC， Riley C，et al. Cross talk of signals between EGFR and IL-6R through JAK2/STAT3 mediate epithelial-mesenchymal transition in ovarian carcinomas[J]. Br J Cancer，2009，100（1）：134-144.

[4] Xiong H，Zhang ZG Tian XQ，et al. Tnhibition of JAK1，2/STAT3 signaling induces apoptosis，cell cycle arrest and reduces tumor cell invasion in colorectal cancer cells[J]. Neoplasia，2008，10（3）：287-297.

[5] 祝立和，卢洪胜，周凯敏，等. STAT3蛋白激活与乳腺浸润性导管癌上皮间质转化的相关性研究[J].中国现代医生，2012，50（17）：106-109.

[6] Huang HC，Hu CH， Tang MC， et al. Thymosin beta4 triggers an epithelial-mesenchymal transition in colorectal carcinoma by upregulating integrin-linked kinase[J]. Oncogene，2007，26（19）：2781-2790.

[7] Dohadwala M， Yang SC，Luo J，et al. Cyclooxygenase-2-dependent regulation of E-cadherin：prostaglandin E（2） induces transcriptional repressors ZEB 1 and snail in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res，2006，66（10）：5338-5345.

[8] Fisher JF， Mobashery S.Mechanism-based profiling of MMPs[J]. Methods Mol Biol， 2010，622： 471-487.

[9] Zhang Y，Wu XH，Cao GH，Li S. Relationship between expression of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and angiogenesis in renal cell carcinoma[J]. Ai Zheng，2004，23（3）：326-329.

[10] 李靖若，李盂圈，鲍俊涛，等． 乳腺癌患者肿瘤转移相关基因1和基质金属蛋白酶9的表达及意义[J]. 中华医学杂志，2008，88（32）：2278-2280．

[11] Li HC，Cao DC，Liu Y，et a1． Prognostic value of matrix metalloDroteinases（MMP-2 and MMP-9）in patients with lymph node-negative breast carcinoma[J]． Breast Cancer Res Treat，2004，88（1）：75-85.

[12] Levy DE， Darnell JE， Jr. Stats：transcriptional control and biological impact [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（9）：651-662.

[13] Wu Yongzhong，Iman Diab，Zhang Xueping，et al. STAT3 enhances vimentin gene expression by binding to the antisilencer element and interacting with the repressor protein，ZBP-89[J]. Oncogene，2004，23：168-178.

[14] Xie TX， Wei D， Liu M， et al. STAT3 activation regulates the expression of matrix metalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis[J].Oncogene，2004，23（20）：3550-3560.

[15] Dechow TN，Pedranzini L，Leitch A，et al． Requirement of matrix metalloproteinase-9 for the transformation of human mammary epithelial cells by STAT3 C[J]． Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：10602-10607．

[16] Xie TX，Huang FJ，Aldape KD，et al． Activation of STAT3 in human melanoma promotes brain metastasis[J]． Cancer Res，2006，66：3188-3196．

（收稿日期：2012-05-24）