TIP30基因启动子甲基化与大肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性关系的研究

[摘要] 目的 探讨TIP30启动子CpG岛甲基化状态与大肠癌细胞对奥沙利铂敏感性的关系。 方法 采用MTT法检测HCT116和HT29大肠癌细胞株对L-OHP的敏感性。通过甲基化特异性PCR，检测对奥沙利铂敏感性有差异的2个大肠癌细胞株中TIP30基因启动子CpG岛甲基化状态，并用RT-PCR法检测其mRNA表达。 结果 HCT116及HT29细胞中TIP30基因甲基化状态存在差异，其表达水平与启动子CpG岛甲基化状态有关，并且二者对奥沙利铂的敏感性不同。 结论 TIP30基因启动子甲基化状态可能影响大肠癌细胞对化疗药物的敏感性，为大肠癌患者的个体化治疗提供了依据。

[关键词] 大肠癌；DNA甲基化；奥沙利铂；化疗药物敏感性

[中图分类号] R735.34   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）04-14-03

Study on correlation of the methylation status of CpG islands in the promoter region of TIP30 tumor suppressor gene with the L-OHP chemosensitivity in 2 colorectal cancer cells

CHEN Xiaobing  MA Yijie  CHEN Beibei  LV Huifang  LI Ning  DENG Wenying  LUO Suxia

Department of Oncology,the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University Henan Cancer Hospital,Zhengzhou 450008,China

[Abstract] Objective To explore the relationship between the methylation status of CpG islands in the promoter region of TIP30 genes in colorectal cancer cells and their sensitivity to Oxaliplatin in the 2 colorectal cancer cells. Methods MTT assay was applied to evaluate the sensitivity to 5-Fu in HCT116 and HT29 colorectal cells;Methylation-specific PCR was used to detect promoter CpG island methylation status in HCT116 and HT29colorectal cells;RT-PCR was used to measure TIP30 mRNA expression. Results TIP30 gene displayed differential DNA methylation pattern between the HCT116 and HT29 cell lines．The mRNA expression level of it was correlated with the methylation status of CpG islands. The sensitivity to L-OHP was different in HCT116 and HT29 cells. Conclusion Our data indicate that methylation status of TIP30 is associated with chemosensitivity in colorectal cells. It may make individualized treatment be possible in patients with colorectal cancer.

[Key words] Colorectal cancer;DNA methylation;Oxaliplatin;Chemosensitivity

近二十年来，大肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率呈逐年上升趋势，严重威胁人类的健康[1]。据统计，世界范围内2007 年新增大肠癌病例数为120万，比2000年增加27%，年均增长3.9%[2]。随着生活水平提高和生活方式的改变，我国大肠癌发病率和病死率呈明显上升趋势，其发病率在各种恶性肿瘤中排第3位，死亡率已位居恶性肿瘤第4~5位之间，并呈现增加趋势[3]。

研究表明，肿瘤发生是基因突变、基因缺失等经典遗传学改变与基因表观遗传学异常共同作用的结果[4]。近年来，基因表观遗传学研究越来越受到重视，其中，DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）法进行DNA甲基化的检测，可对DNA甲基化状态作出定性的判定[5]。一些基因启动子区域CpG岛异常甲基化介导的异常转录，与肿瘤对化疗药物的耐药性密切相关，如：药物转运相关基因[6]、DNA错配修复基因[7]等启动子CpG岛高甲基化，谷胱甘肽巯基转移酶P1[8]等CpG岛低甲基化。TIP30是近年来受到广泛关注的抑癌基因，许多研究提示TIP30启动子甲基化状态与大肠癌患者淋巴结转移数目、血清CEA水平相关，但与化疗药物敏感性是否相关目前少见报道。笔者在前期研究中发现，TIP30启动子甲基化状态与大肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性高度相关，本实验旨在进一步探讨目前广泛用于大肠癌治疗的另一种药物奥沙利铂的疗效与TIP30启动子甲基化状态是否也有关。本研究通过测定奥沙利铂对两种大肠癌细胞的半数抑制浓度（IC50，50％细胞死亡所需的药物剂量），探讨大肠癌细胞甲基化状态与奥沙利铂疗效的相关性，为大肠癌个体化治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及细胞培养

大肠癌HCT116及HT29细胞购自中国医学科学院细胞中心，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液、37℃、5%CO2条件下培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行药物敏感性实验。

1.2 MTT法检测大肠癌细胞对L-OHP的敏感性

将1×104/mL的大肠癌细胞接种于96孔板，24 h后加入不同浓度的L-OHP，同时设阴性对照组和空白对照组，每个梯度设3个复孔。72 h后，每孔加入MTT 150 μL。4 h后离心，弃去孔中液体，每孔再加入DMSO 100μL。10 min后，应用全自动酶标仪，于570 nm波长处测定吸光度（A）值，计算生长抑制率，绘制细胞生长抑制曲线，确定大肠癌细胞的化疗药物半效抑制浓度（IC50）。生长抑制率=（A对照组－A实验组）/（A对照组－A空白组） ×100%。

1.3 MSP检测基因CpG岛的甲基化状态

1.3.1 细胞处理 将大肠癌HCT116及HT29细胞重悬，接种于6孔板中培养，待细胞处于对数生长期时，分别加入5-aza-2"-deoxycytidine（5-杂氮脱氧胞嘧啶，DAC），终浓度为10µM/L，隔天更换含相同药物浓度的新鲜RPMI 1640培养液，培养3 d后收集细胞备用。对照组细胞采用相同体积的D-Hanks液处理。

1.3.2 基因组DNA的提取 将细胞清洗后移入离心管，1500 g离心2 min。去上清液后加入400μL lX细胞裂解液摇匀，再加入20 mg/mL蛋白酶K 4μL，50℃培养2 h，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀、溶解。-20℃保存备用。

1.3.3 DNA亚硫酸氢盐处理 1μg模板DNA，补水至20μL，加入3 mol/L NaOH 2.2μL，37℃20 min。加入230μL NH4HSO3后混匀，加石蜡油覆盖液面，90℃30 min。吸去石蜡油，加入500μL溶胶液，混匀后过柱，用漂洗液洗1次。加入0.3 mol/L NaOH （50%乙醇）300μL，室温放置15 min，离心去除废液，漂洗液洗2次，200μL TE洗脱后，-20℃保存备用。

1.3.4 TIP30基因进行CpG岛甲基化状态检测 根据TIP30基因启动子DNA片段设计引物，上游引物为5’ TTTGGGTGAGTTGAGTTTAGTAGG3’；下游引物为5’ TACCACAAACTACTAACATC ACTAAAC 3’。PCR反应体系含处理过的DNA 1μL，10×Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，5 mmoL/L上、下游引物各1μL，Blend-plus酶0.5μL。PCR反应条件：95℃3 min；94℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，35个循环；72℃ 7 min。PCR产物电泳后，切胶回收，进行T-A克隆，挑取阳性克隆进行测序。

1.4 逆转录PCR检测大肠癌细胞株中TIP30基因的mRNA表达

1.4.1 RNA的抽提 用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，按照说明分别提取大肠癌HCT116及HT29细胞株的总RNA。

1.4.2 RT-PCR检测 根据TIP30基因片段设计引物，上游引物5’GTCTTTATTT TGGGCGCCAG 3’， 下游引物5’CCCAGCTTTCCCTCTGGTGG 3’，内参照由TaKaRa公司合成，上游引物5’ GCCTCCGGCAGGACCACCGG3’，下游引物5’ CGGTGAGATCGCGGCCCGCC3’ 。先进行逆转录，oligo（dT）、SuperscriptⅡTM RNase H逆转录酶均为Invitrogen公司生产。

2 结果

2.1 两种大肠癌细胞株中TIP30启动子甲基化状态

经MSP法扩增，如图1所示：未经DAC处理的HCT116细胞TIP30基因完全甲基化，而经DAC处理的HCT116细胞TIP30基因变成未甲基化；经DAC处理后，TIP30基因在HT29细胞中从部分甲基化变成了未甲基化。DAC处理均使这两株大肠癌细胞TIP30基因发生了去甲基化改变。

图1  MSP检测HCT116与HT29细胞中TIP30基因甲基

化状态。-：DAC处理前细胞；+：DAC处理后细胞；

M：甲基化引物扩增产物；U：未甲基化引物扩增产物

2.2 两种大肠癌细胞DAC处理前后TIP30 mRNA转录水平的变化

RT-PCR结果见图2：未经DAC处理的HT29细胞TIP30mRNA弱表达，HCT116细胞TIP30mRNA不表达；而经DAC处理后，HT29细胞株TIP30mRNA表达较DAC处理前明显增强，RT-PCR检测到了HCT116细胞株的TIP30mRNA表达，提示DAC处理使大肠癌细胞株中TIP30mRNA表达水平明显上调。

图2  RT-PCR检测HCT116、HT29细胞DAC处理前后TIP30 mRNA

表达水平。-：DAC处理前细胞；+：DAC处理后细胞

2. 3 大肠癌细胞对L-OHP的敏感性

L-OHP对HCT116及HT29细胞的生长抑制曲线见图3。HCT116及HT29细胞的IC50分别为（9.90±0.51）和（5.52±0.46）µmol/L。

图3L-OHP对HCT116及HT29细胞的生长抑制曲线

3 讨论

启动子是基因中与RNA聚合酶结合并启动转录的DNA序列，决定着转录起始位点、控制着mRNA转录水平与转录的组织特异性。抑癌基因失活与其启动子高甲基化有关，启动子高甲基化可使肿瘤抑癌基因沉默，阻碍该基因转录与表达，是许多恶性肿瘤发生与发展的重要机制之一。

目前多项研究证实，在大肠癌中多种基因CpG甲基化导致基因沉默，其中包括MLH1（错配修复蛋白1）、MGMT（O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶）、P16、P14、HLT、Netrin-1、APC（家族性腺瘤息肉病基因）、HACE、CDX1（同源异型框转录因子）和SPARC（人富含半胱氨酸型酸性蛋白）等[9-11]。TIP30基因是近年新发现的一种与肿瘤转移抑制相关的基因，定位于人染色体11p15.1，由6个外显子组成，编码242个氨基酸残基组成的蛋白质，相对分子质量为30 000。TIP30产物蛋白属于短链脱氢酶和还原酶超家族成员，能够和NADPH相结合感受细胞内的氧化还原状态，发挥重要的生物学功能[12]。此外，TIP30还具有丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶活性，可以自身磷酸化也可以磷酸化RNA聚合酶Ⅱ最大亚基C末端的七肽重复序列，特异性地调节相关基因转录，参与细胞调控。前期研究表明，TIP30基因在人类正常组织如心、脑、肾、胰腺等均有表达，而在肝癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌等多种肿瘤组织中表达下降或缺失。

Ito等[13]研究发现，与癌旁组织及正常组织相比，大肠癌组织中TIP30蛋白表达水平明显降低，大肠癌的发生和TIP30蛋白的表达水平下降或缺失有关。在本研究中，RT-PCR结果显示：在大肠癌细胞株中，TIP30 mRNA表达也是降低或缺失的。其中HCT116细胞TIP30 mRNA表达缺失，HT29 TIP30 mRNA表达降低。为了进一步研究大肠癌细胞株中TIP30 mRNA表达降低或缺失的原因，笔者对TIP30启动子CpG岛甲基化进行了检测。MSP结果显示：TIP30基因启动子在高转移性、低分化的大肠癌细胞株HCT116和非高转移性的大肠癌细胞株HT29中存在CpG岛高甲基化，特别是在高转移潜能的HCT116细胞中，TIP30基因启动子的CpG岛存在大量高甲基化。这些结果初步表明，大肠癌细胞株中TIP30基因启动子CpG岛甲基化可能是TIP30基因表达降低或缺失的机制之一。这些结果也进一步证明，启动子CpG岛甲基化导致基因沉默，是抑癌基因失表达的主要机制之一。

张霞等[14]研究也发现，TIP30蛋白在大肠癌组织中表达降低，与临床分期及浸润转移有关；笔者前期研究也得到了相似的结果[15]。50例大肠癌和配对正常大肠组织中，TIP30蛋白表达缺失分别为20例（40%）和5例（10%），两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。MSP结果显示在50例正常大肠黏膜组织中未见TIP30启动子高甲基化，而在50例大肠癌患者中有18例（36%）TIP30启动子为高甲基化。BSP测序验证MSP的实验结果，两种方法结果基本一致。18例TIP30启动子高甲基化的患者中有12例（66.7%）TIP30蛋白表达缺失，32例TIP30启动子未甲基化的患者中有8例（25%）TIP30蛋白表达缺失，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。而且结果表明：TIP30启动子甲基化状态与患者临床病理指标的相关性发现，大肠癌TIP30启动子高甲基化与患者淋巴结转移情况、CEA水平及临床分期之间存在显著相关性。

在前期研究基础上，为探讨TIP30启动子高甲基化与化疗疗效的关系，笔者就其对化疗药物奥沙利铂的敏感性做了研究。研究结果显示，奥沙利铂对HCT116细胞及HT29细胞的IC50分别为（9.90±0.51）和（5.52±0.46）µmol/L，表明HCT116细胞对奥沙利铂敏感度差，HT29细胞对奥沙利铂较敏感，而HCT116和HT29细胞甲基化程度又不同，并且其启动子甲基化差异可能是导致抑癌基因沉默的机制，这些结果提示， TIP30基因启动子CpG岛甲基化状态可能和大肠癌细胞株的化疗敏感性相关，但这仍需要更深一步的研究来进行验证。

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（收稿日期：2011-12-08）