β—tubulinⅢ、ERCC—1在非小细胞肺癌中的表达和临床意义

【摘要】 目的：检测β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况及其与生存期的关联性。方法：Envision法检测资料完整的120例NSCLC中β-tubulin Ⅲ、ERCC-1的表达，所有病例均予以顺铂或紫杉醇为主的辅助联合化疗，随访生存期。结果：β-tubulin Ⅲ在NSCLC中的阳性表达率小于正常肺组织中，但差异无统计学意义（P>0.05）。ERCC-1在NSCLC中的阳性表达率明显大于正常肺组织（P<0.05）。β-tubulin Ⅲ、ERCC-1的表达和性别、年龄、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移均无相关性（P>0.05），β-tubulin Ⅲ的表达与分化程度相关（P<0.05）。β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）生存期最长，β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（+）生存期最短。结论：β-tubulin Ⅲ可能参与介导肺癌的生长、侵袭。β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）的NSCLC患者可能从以顺铂或紫杉醇为主的辅助联合化疗中受益。

【关键词】 β-tubulin Ⅲ； ERCC-1； 非小细胞肺癌； 阳性表达率

【Abstract】 Objective：To detect the expression and the relationship between expression and life of β-tubulin Ⅲ，

ERCC-1 in non-small cell lung cancer.Method：120 cases of NSCLC of expression of beta-tubulin Ⅲ and ERCC-1

were detected by the Envision method，and all cases were treated with cisplatin or paclitaxel based adjuvant chemotherapy，followed up for survival.Result：The positive expression rate of β-tubulin Ⅲ in non-small cell lung cancer was lower than that in normal lung tissue，but there was no significant difference （P>0.05）.The positive expression rate of ERCC-1 in non-small cell lung cancer was significantly higher than that in normal lung tissue （P<0.05）.There was no correlation between the expression of β-tubulinⅢ and ERCC-1 and sex，age，histological type，TNM staging and lymph node metastasis（P>0.05），the expression of β-tubulin Ⅲ was related to the degree of differentiation （P<0.05）.The survival time of β-tubulin Ⅲ（-） and ERCC-1（-） was the longest，and the survival time of β-tubulin Ⅲ（+） and ERCC-1（+） was the shortest.Conclusion：The β-tubulin Ⅲ may be involved in the growth and invasion of lung cancer.The β-tubulin Ⅲ（-） and ERCC-1（-） of patients with NSCLC may benefit from adjuvant chemotherapy based on cisplatin or paclitaxel.

【Key words】 β-tubulin Ⅲ； ERCC-1； Non-small cell lung cancer； Positive expression rate

First-author’s address：Traditional Chinese Medicine Hospital of Huizhou City，Huizhou 516000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.20.006

肺癌是目前世界各地中最常见的恶性肿瘤之一，且死亡率增长最快，WHO肺癌居癌症死因第一位，对人类生命健康造成严重威胁。其中综合治疗仍然是占比约80%的非小细胞性肺癌（NSCLC）的首选治疗方式，化疗占有重要地位，但5年生存率改善幅度低于5%。探究其化疗效果欠佳的原因，主要为化疗药物耐药，无法杀伤肿瘤细胞[1-3]。研究报道显示，微管蛋白β-tubulin Ⅲ可能与紫杉醇耐药有关，切除修复交叉互补基因1（ERCC-1）可能与铂类耐药有关[3]。本文采用回顾性研究，检测120例非小细胞肺癌组织β-tubulin Ⅲ、ERCC-1表达情况及临床病理特征，表达水平与生存期的相关性，为临床提供依据，以更高制定科学合理的化疗方案和预后评估手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2002年10月-2004年11月南昌大学第一附属医院的120例非小细胞肺癌组织标本，均经电子支气管镜活检、经皮肺穿或外科手术切除，作为NSCLC组，所有病例均予以顺铂或紫杉醇为主的辅助联合化疗，术前未行放化疗，术后均经病理确诊为非小细胞肺癌；排除重大系统严重疾病，并传染性疾病，不可耐受化疗者。其中男67例，女25例，年龄35～79岁，平均（56.3±12.3）岁；病理分型：65例鳞癌（高分化16例，中分化26例，低分化23例），55例腺癌（高分化18例，中分化21例，低分化16例）。另外取10例NSCLC患者的距肿瘤病变>10 cm的無癌细胞浸润正常肺组织作为对照组，男8例，女2例。本研究已通过本院伦理委员会审批，患者均知情同意并签署相关同意书。术后随访时间3～5年。

1.2 试剂 即用型β-tubulin抗体购自上海美吉生物公司，1∶200 ERCC-1抗体购自美国Amgen生物公司，Envision试剂盒购自美吉生物公司，兔抗人多克隆抗体购自美国Amgen生物公司。

1.3 实验方法 检测β-tubulin Ⅲ、ERCC-1表达情况：采用免疫组化染色（Envision法）。石蜡切片脱蜡和水化后，用pH 7.4的PBS冲洗，3 min/次，共3次，使用微波炉修复组织抗原，每张切片上滴加

1滴或50 μL 3%H2O2溶液于室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每张切片上滴加1滴或50 μL的第一抗，于室温孵育60 min。PBS冲洗，3 min/次，共

5次，甩去PBS液，每张切片上滴加1滴或50 μL聚合物增强剂（试剂A），于室温孵育，20 min。PBS冲洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每张切片加1滴或50 μL酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），在室温下孵育30 min，PBS冲洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每张切片上加2滴或100 μL新鲜配制的DAB后，于显微镜下观察3～10 min，若颜色为红或棕色，为阳性。然后用蒸馏水冲洗，添加苏木素复染，0.1%盐酸分化，用自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。将梯度的酒精脱水干燥，中性树胶封片。以PBS为阴性对照，病理科已有的β-tubulin、ERCC-1阳性染色的肺癌石蜡切片为阳性对照。

1.4 免疫组化结果判读

1.4.1 β-tubulin Ⅲ表达 瘤细胞胞浆内（包括瘤细胞核周）出现清晰的黄色着色颗粒为阳性。并根据阳性肿瘤细胞的占比分为五等级：（1）0分为阳性细胞<5%；（2）1分为5%≤阳性细胞≤25%；（3）2分为26%≤阳性细胞≤50%；（4）3分为51%≤阳性细胞≤75%；（5）4分为阳性细胞>75%[3]。另外染色强度评分：0分为无色；1分为淡黄；2分为棕黄；

3分为棕褐。阳性细胞分值×染色强度分值=总分，当总分为9～12分时为强阳性（+++），6～8分时为阳性（++），3～5分时为弱阳性（+），1～2分时为可疑（±），0分时为阴性（-），其中（-）和（±）为阴性表达[4]。

1.4.2 ERCC-1表达 当细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，按阳性细胞占比及染色强度进行评估，阳性细胞≥75%为强阳性（+++），50%≤阳性细胞≤74%为阳性（++），25%≤阳性细胞≤49%为弱阳性（+），阳性细胞<25%为阴性（-）[5]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验或Fisher精确检验，使用单因素生存分析，采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验。当P<0.05时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC和正常肺组织中的表达 β-tubulin Ⅲ在NSCLC细胞浆内阳性表达率为73.3%（88/120）；低分化癌中大部分以阴性和弱阳性表达，黄染大部分较浅。β-tubulin Ⅲ

在正常肺组织中阳性表达率为100%（10/10），β-tubulin Ⅲ在NSCLC的阳性表达率小于正常肺组织，但差异无统计学意义（P>0.05）。ERCC-1在NSCLC细胞核内阳性表达率为40.0%（48/120），其中8例为强阳性；ERCC-1在正常肺组织中ERCC-1阳性表达率为0，即全阴表达；ERCC-1在NSCLC的阳性表达率明显大于正常肺组织，差异有统计学意义（字2=6.335，P<0.05）。见表1和图1、2。

2.2 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的表达情况与临床病理参数的关系 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的表达与性别、年龄、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移均无显著相关性（P>0.05），β-tubulin Ⅲ在NSCLC中的表达与分化程度显著相关（P<0.05），ERCC-1在NSCLC中的表达与分化程度相关性（P>0.05），见表2。

2.3 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的共同表达和生存期的关系 在120例NSCLC中，中位生存期

<5年的：β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）15例（12.5%），β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（-）41例（34.2%），β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（+）37例（30.8%），β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（+）27例（22.5%）。

3 讨论

相关研究显示，细胞骨架蛋白的异常表达及分布可能与肿瘤化生中细胞病理表型及病理生理过程相关[6-7]，其中β-tubulinⅢ表达在细胞浆内，ERCC-1表达在细胞核内。本研究结果显示，β-tubulinⅢ在NSCLC中的表达低于正常肺组织，低分化癌中大部分以阴性和弱阳性表达，β-tubulinⅢ在正常肺组织中全阳性表达。这提示，β-tubulinⅢ的表达下调可能与肺癌的生长、侵袭有关，可能是包含MDR基因在内的癌细胞基因突变，改变了内部核酸序列及酶，使β-tubulin在NSCLC中的表达情况与正常组织有异[8-12]；并且β-tubulinⅢ具有一定的生理保护作用，可防御化学致癌物及毒素[13-15]；β-tubulinⅢ的表达与组织学类型无关，提示β-tubulinⅢ与临床分期无关，不是恶变的特征，肿瘤的浸润程度不能代表耐药性的差异[16]。

目前，临床认为β-tubulin是多种化疗药物的作用靶点，其中包括紫杉类，而紫杉类耐药主要是因为β-tubulin过度表达。因此，临床上晚期NSCLC仍以含铂方案化疗为主。顺铂主要通过与细胞DNA双链耦合形成加合物或形成链间交叉连接，抑制DNA复制，诱导肿瘤细胞凋亡。顺铂耐药机制包括减少细胞毒的铂-DNA复合物形成，以及铂-DNA复合物形成后防止细胞死亡[17]，为内源性或获得性耐药。而ERCC-1是核苷酸切除修复系统（NER）中DNA损伤识别和链间切割的关键成分[18]。而NER存在于大肠杆菌中，是修复DNA损伤的重要途径，包含XPC-HHRAD23、XPA、RPA、DNA连接酶等基因，其中ERCC-1為损伤碱基5′-3′的切割酶，尤其重要，可识别损伤DNA5′，缺失ERCC-1的细胞组织无法修复顺铂所致的DNA损伤[19-20]。

目前多数报道表明，ERCC-1与临床疗效多为负性相关。本研究结果显示，β-tubulin、ERCC-1在NSCLC中的表达与性别、年龄无关，在中-高分化肺癌中表达大于低分化。这提示，肺癌耐药的发生与性别、年龄无关，低分化的肺癌在对抗癌药物的耐药性，其耐药性会下降，与临床的化疗敏感现象相符。

综上所述，β-tubulinⅢ可能参与介导肺癌的生长、侵袭，β-tubulinⅢ（-）、ERCC-1（-）的NSCLC患者可能从以顺铂或紫杉醇为主的辅助联合化疗中受益。

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（收稿日期：2018-04-08） （本文编辑：张爽）