红花对严重创伤病人外周血中IL-2\IL-2R表达以及CD4\CD8\CD152活性的影响

摘 要 目的：研究红花对严重创伤病人外周血中IL-2、IL-2R的表达以及CD₄、CD₈、CD₁₅₂活性的影响，探讨IL-2、IL-2R及CD₄、CD₈、CD₁₅₂的活性变化在严重创伤转归、预后判断及干预治疗方面的意义。方法：研究对象为2009年1月以来收治的严重创伤病人126例，对照组64例给予常规治疗，试验组62例加用红花注射液20ml/日治疗。于3天、7天两个时间点上，采用ELISA法检测患者外周血IL-2、IL-2R的含量；采用S-P（链亲和素-过氧化物酶）一步法测定患者外周血中CD₄、CD₈的活性；应用酶联免疫吸附法和流式细胞仪检测外周血中CD₁₅₂的表达水平。结果：试验组较对照组患者的CD₄细胞数明显增多（P＜0.01），CD₈细胞数无明显变化（P＞0.05），CD₄/CD₈比值明显增加（P＜0.05或P＜0.01），T细胞表面CD₁₅₂水平明显降低（P＜0.01），血清中sIL-2水平明显升高（P＜0.05或P＜0.01），sIL-2R水平明显下降（P＜0.01）。结论：红花能够明显提高Th细胞分泌IL-2的能力，减少存在于细胞表面游离的可溶性受体（sIL-2R）的表达与释放，CD₄细胞增多，CD₄/CD₈比值增加，并在一定程度上降低T细胞表面CD₁₅₂的表达。该研究在探讨严重创伤后的免疫功能紊乱的发生机制、临床治疗和预后判断方面有重要意义。

关键词 红花 严重创伤 IL-2 IL-2R T细胞亚群 CD₁₅₂（CTLA-4）

近年来的研究表明，严重创伤可引起机体免疫功能紊乱，它的发生、发展与机体的免疫功能状态有着密切的关系，尤其与淋巴细胞及淋巴因子的免疫关系密切^［1,2］。因此，有关创伤与淋巴细胞的研究已经成为创伤免疫领域中的研究热点。本研究测定了117例患者外周血中sIL-2、sIL-2R的含量以及CD₄、CD₈、CD₁₅₂（T细胞表面）细胞数的变化，以进一步探讨红花对创伤免疫指标的影响，从而为创伤的治疗探索新的途径和方法。

资料与方法

一般资料：样本为我院从2009年1月收治的严重创伤病人126例（ISS评分均＞25分），年龄、性别和体重不限。红花注射液，IL-2、IL-2R定量试剂盒，淋巴细胞亚群检测试剂盒，酶联免疫检测仪，流式细胞仪（FCM）（Beckman Coulter）。

方法：将126例病人随机分为对照组64例，试验组62例。对照组患者入院后给予常规治疗，试验组患者在常规治疗的基础上加用红花注射液，剂量为20ml/日，疗程为7天。于3天、7天两个时间点抽取患者空腹外周血，用于检测。

免疫学指标的检测：①外周血中IL-2、IL-2R的含量检测用ELISA法；CD₄、CD₈的活性测定用S-P一步法；均参照试剂盒说明书进行操作。②T细胞表面CD₁₅₂的检测:先在试管中加入2ml淋巴细胞分离液，再将抽取的外周血等量缓慢加入到试管中，2000rpm离心20分钟；用细长毛细吸管伸之呈云雾状的中间层细胞轻轻全部吸取，即提取出所有单个核细胞，用10%FCS（杭州四季青）和RPMI1640调整细胞浓度为1×10⁷ /ml待测；准备无菌塑料离心管，标记后分别加入CD₄单抗和CD₈单抗各10μl，每管内加入调配好的淋巴细胞提取液40μl，再加1:20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（SIGMA）50μl，4℃孵育30分钟；用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml，1000rpm离心5分钟；弃上清，加入50μl荧光标记的羊抗鼠二抗，充分振摇，4℃孵育30分钟；用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml，1000rpm离心5分钟；弃上清，加1ml固定液，充分振摇；FCM检测。

统计学处理：计量资料以均数±标准差（X±S）表示，进行t检验，采用SPSS12.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有显著意义。

结 果 见表1～4。

讨 论

大量研究表明^［3,4］，严重创伤可致T细胞功能受抑，进而引起细胞免疫功能低下。T淋巴细胞可分为两大亚群，Th和Ts，Th表面带有T4标志（小鼠为Lyt-1和L3L4），称为CD₄，主管迟发性变态反应和辅助功能；Ts表面带有T8标志（小鼠为Lyt-2），称为CD₈，主管细胞毒性和抑制功能。既往试验表明：严重创伤后T淋巴细胞功能明显异常，主要表现为CD₄₊ 和CD₈₊T细胞活力受损,CD₄₊/CD₈₊比例下降，出现不成熟T细胞,Th1细胞向Th2 细胞异常转化，NK细胞和淋巴因子激活杀伤细胞活力下降等。白细胞介素2（Interleukin-2）是T淋巴细胞受抗原或致分裂原刺激后产生的一种淋巴因子，具有促进淋巴细胞有丝分裂，增强杀伤细胞（如T杀伤细胞、NK细胞）的杀伤功能和辅助抗体生成等生物学作用，它是Morgan1976年在活化的淋巴细胞中发现的。IL-2的生物学作用必须通过和靶细胞上特异性高亲和力的IL-2R相互作用才能完成。白细胞介素2受体有两种，即存在于细胞表面的IL-2膜受体（mIL-2R）和存在于体液中的可溶性IL-2受体（sIL-2R），这两种受体都可结合IL-2，中和活化T细胞周围过多的白介素2，具有免疫调控作用。

CTLA-4即CD₁₅₂，是一种糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，它与CD₂₈高度同源，而且和CD₂₈有着共同的配体B7，但CTLA-4与B7的亲和力则是CD₂₈的20倍。已有研究表明^［5,6］，正常情况下，CTLA-4。绝大部分定位于胞内,在细胞表面CTLA-4的表达很低，CTLA-4在细胞表面的表达和向胞内的转化过程被高度调节，CTLA-4在细胞表面的持久表达依赖于CTLA-4分子胞质域——酪氨酸残基（Y165）的磷酸化作用。严重创伤后机体释放的多种内源性因子反复刺激，影响了酪氨酸的磷酸化水平，使得CTLA-4内聚发生障碍，出现T细胞表面CTLA-4分子高水平表达。由于CTLA-4分子胞内段带有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM），CTLA-4可通过与TCR链结合来抑制T细胞活化后的酪氨酸磷酸化作用,从而抑制TCR活化信号的转导，发挥其免疫负向调节作用。另一方面，由于CTLA-4和CD₂₈有着共同的配体B7，而且CTLA-4与B7的亲和力是CD₂₈的20倍。因此，CTLA-4通过与CD₂₈竞争共同的配体B7，从而拮抗CD₂₈介导的共刺激作用，进一步对T细胞的活化起抑制作用。这与Carreno等^［7］的研究结果一致，即在B7依赖的共刺激下，CTLA-4对T细胞IL-2产生的抑制作用与CTLA-4的表面表达呈正相关性。

本研究测定结果，试验组较对照组患者的CD₄细胞数明显增多，CD₈细胞数无明显变化，CD₄/CD₈比值明显增加，T细胞表面CD₁₅₂水平明显降低，血清中sIL-2水平明显升高，sIL-2R水平明显下降，揭示红花对严重创伤病人的免疫功能有一定的正性调节作用。血清sIL -2水平是末梢血单核细胞功能的一个敏感而又量化的指标，它可以影响其他组织或体液成分的免疫活性，其含量在一定程度上反映创伤的严重程度^［8］，其水平变化与创伤有着密切的关系；而以往实验表明，严重创伤后T细胞功能受抑制与T细胞表面CTLA-4分子高表达密切相关。本文测定试验组较对照组患者血清中sIL-2水平升高，sIL-2R水平下降，T细胞表面CD₁₅₂表达水平明显降低，说明血清中sIL -2活性增高，sIL-2R对其免疫抑制作用减弱，其机理可能是红花作用于激活的T淋巴细胞，使其对IL-2R表达与释放减少并在一定程度上降低T细胞表面CTLA-4分子的高表达有关。IL-2R可结合血清中的IL -2，具有免疫抑制作用，而CTLA-4对T细胞IL-2也在一定程度上产生抑制作用，其抑制强度与创伤病人的预后有着密切关系。

本研究是通过红花对严重创伤病人的干预治疗，在不同时间点上测定外周血中sIL-2、sIL-2R的含量以及CD₄、CD₈、CD₁₅₂细胞数的变化，结果显示红花治疗组较对照组患者的CD₄细胞数明显增多，CD₈细胞数无明显变化，CD₄/CD₈比值明显增加，T细胞表面CD₁₅₂水平明显降低，血清中sIL-2水平明显升高，sIL-2R水平明显下降，进而在一定程度上说明红花对T淋巴细胞表达和释放IL-2R和CD₁₅₂有一定的影响，从而能证明红花对严重创伤病人的免疫功能有一定的正性调节作用。关于红花影响严重创伤病人免疫功能的确切机理还有待于进一步探讨。

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表1 伤后3天患者外周血IL-2、IL-2R的含量（X±S,%）

^* 与对照组比较P＜0.05，^△ 与对照组比较P＜0.01

表2 伤后7天患者外周血IL-2、IL-2R的含量（X±S,%）

^△ 与对照组比较P＜0.01

表3 伤后3天患者T淋巴细胞群测定结果（X±S,%）

^* 与对照组比较P＜0.05，^△ 与对照组比较P＜0.01，^▲ 与对照组比较P＞0.05

表4 伤后7天患者T淋巴细胞群测定结果（X±S,%）

^△ 与对照组比较P＜0.01，^▲ 与对照组比较P＞0.05