Treg与Th17细胞在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+细胞中的表达变化及意义

【摘要】 目的：研究Treg与Th17细胞在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+细胞中表达百分率的变化及意义，探讨其在慢性丙型肝炎发病中的作用。方法：使用四色流式细胞仪，分别检测慢性丙型肝炎患者和正常健康人外周血CD4+细胞中Treg与Th17细胞的表达百分率情况，并分别计算Treg/Th17值。结果：慢性丙肝组与健康对照组的Treg细胞百分率比较[（7.56±1.32）% vs（5.05±0.46）%，P<0.01]，Th17细胞百分率比较[（2.12±0.55）% vs（1.19±0.12）%，P<0.01]，Treg/Th17细胞比例比较[（3.66±0.42）vs（4.25±0.45），P<0.01]。且Treg细胞与Th17表达百分率HCV-RNA病毒载量呈正线性相关，与转氨酶ALT含量无关。结论：可以将Treg、Th17细胞亚群的含量作为快速辅助判断丙肝患者所处感染的不同临床时期的有效证据。

【关键词】 流式细胞术； Treg细胞； Th17细胞； 慢性丙型肝炎

Expression Changes and Significance of Treg and Th17 Cells in Peripheral Blood CD4+ Cells in Chronic Hepatitis C/CHANG Qingyan，ZHU Jie，ZHANG Xiaohui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（32）：014-018

【Abstract】 Objective：To study the changes and significance of Treg and Th17 cells in peripheral blood CD4+ cells in patients with chronic hepatitis C and to explore its role in the pathogenesis of chronic hepatitis C.

Method：The expression percentage of Treg and Th17 cells in CD4+ cells in patients with chronic hepatitis C and normal healthy people were detected by four-color flow cytometry，and Treg/Th17 was calculated respectively.Result：The percentage of Treg cells in patients with chronic hepatitis C and normal healthy people were（7.56±1.32）%，（5.05±0.46）%，Th17 cells percentage were （2.12±0.55）%，（1.19±0.12）%，Treg/Th17

cells proportion were （3.66±0.42），（4.25±0.45），there were statistical significance（P<0.01）.And the percentage of Treg and Th17 cells was positive linear correlation with HCV-RNA viral load and had nothing to do with the elevation of ALT.Conclusion：The contents of Treg and Th17 cell subgroups can be used as the effective evidence for the rapid adjuvant assessment of the different clinical stages of infection in patients with chronic hepatitis C.

【Key words】 Flow cytometry； Treg cell； Th17 cell； Chronic hepatitis C

First-author’s address：Dalian Sixth People’s Hospital，Dalian 116113，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.32.004

丙肝发病和转归机制与Treg与Th17这两类不同的细胞亚群失去平衡密切相关。尽管Treg、Th17的免疫应答与胞内感染涉及到的防御和清除有关，但这两者的参与同时也可以导致肝组织损伤。适宜的Treg、Th17免疫应答能够有效清除HCV感染，提示可以研究出有效的免疫调节治疗方法，即通过调节Treg和Th17的平衡来清除病毒。因此，笔者采用流式细胞仪对慢性丙肝患者外周血T細胞亚群中的Treg与Th17的表达情况进行详细分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经过大连市第六人民医院伦理委员会批准，患者被知情告知，并已签署知情同意书。本研究中慢性丙型肝炎患者均符合2015年《丙型肝炎防治指南》慢性丙型肝炎的诊断标准，排除与HBV混合感染及与HIV混合感染的患者，排除有严重肝功能障碍、严重心脏病史及严重精神病史患者，排除妊娠及哺乳期的患者，为未经抗病毒治疗的初治成年患者。本研究中慢性丙型肝炎患者均由辽宁省大连市第六人民医院招募入组，入组时间为2015年8月-2016年9月，共入组慢性丙型肝炎患者19例（慢性丙肝组），其中男10例，女9例，年龄23～79岁，平均（46.16±15.09）岁；健康受试者均由大连医科大学附属第二医院招募入组，入组时间为2016年5-10月，共入组健康受试者20例（健康对照组），其中男11例，女9例，年龄23～77岁，平均（46.00±11.91）岁。

1.2 仪器与设备 BD FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）、YS72 5KVA净化式交流稳压电源（中国上海科技仪器仪表厂）、HH·W21·600-S电热数显恒温水浴箱（中国跃进医疗器械厂）。

1.3 试剂 主要试剂：FOXP3-PE，CD4-FITC，CD25-APC，PE Rat IgG2a，IL-17-PE单抗购自COULTER公司，CD3-PerCP、CD4-APC、CD3-APC

购自BD公司，鼠FITC-IgG1/PE-IgG1单抗为Pharming公司产品。其他试剂：PMA、Ionomycin、BFA等均购自Sigma公司，RPMI1640购自Gibco公司，固定穿透试剂盒，Cytopem kit购PharMingen公司。

1.4 方法

1.4.1 首先，选择合适的健康人群，分别采取静脉血1 mL，使用肝素作为最佳抗凝剂。两者混匀后，按抗凝后静脉血同RPMI1640（无血清）的培养基按照1∶1的比例在振荡器上充摇混匀。然后，分别向培养皿里注入Neomycin与PMA刺激剂，使得溶质最终浓度分别达到20 ng/mL和1.5 μg/mL，最后加入15 μg/mL的BFA作为蛋白转运抑制剂。未加刺激液的对照组则只加BFA。充分摇匀后，将培养基放置在37.5 ℃、5%CO2条件下的培养箱中培养6 h。随后待用。

1.4.2 （1）Treg细胞检测。①分别拿2支试管并对其编号，将相应患者使用肝素抗凝的外周血100 μL分别加入到相应编号的试管中，充分摇匀。②两只试管中加入10 μL CD4-FITC抗体，其中管A加3 μL CD25-APC抗体，另一管B加3 μL FITC-IgG1，混匀，室温避光保存15～30 min（可根据实验所处环境，参考试剂相应说明书，调整抗体使用情况）。③然后，加入1 mL新鲜制备的e Bioscience Fixation/Demobilization应用液，混匀，室温避光保存30 min。

④取出试管后，分别加入用稀释液稀释10倍的Demobilization Buffer洗液2 mL。使用离心机1500 r/min离心5 min，然后充分弃去上清液。按照上述方法与步骤再清洗三遍。⑤管A加入5 μL FoxP3-PE标记的抗体和管B 1 μL rat IgG2b

与2 μL eBR2a同型对照（e Bioscience）。摇

匀后放于4 ℃的恒温孵育箱内，避光孵育4 h。⑥取出试管，同步骤④洗三遍。⑦充分弃去上清液，同时相应加入1 mL PBS或去离子水，保证在1.5 h内上机实验。（2）Th17细胞检测。①分别拿2支试管并对其编号，将相应患者使用肝素抗凝的外周血100 μL分别加入到相应编号的试管中，充分摇匀，同时分别加入0.5 mL PMA于37 ℃水浴保存6 h。②另取2支试管并编号，将步骤①中两管各取200 μL加入到相应编号C、D的试管中并同时加入20 μL CD4-FITC，混匀，室温避光保存15～30 min（可根据实验所处环境，参考试剂相应说明书，调整抗体使用情况）。③然后，加入1 mL新鲜制备的e Bioscience/Demobilization應用液。混匀，室温避光保存30 min。④取出试管后，分别加入用稀释液稀释10倍的Demobilization Buffer洗液2 mL。使用离心机1500 r/min离心5 min，然后充分弃去上清液。按照上述方法与步骤再清洗三遍。⑤管C加入10 μL IL-17-PE标记的抗体和10 μL IFN-r-FITC，D管加入5 μL IgG2a-PE，混匀放入4 ℃孵育箱避光孵育3 h。⑥取出试管，同步骤④洗两遍。⑦充分弃去上清液，同时相应加入1 mL PBS或去离子水。保证在1.5 h内上机实验

1.4.3 数据获取及分析 首先按照使用说明，进行相应的预实验。通过对预实验的分析，对流式细胞仪的光路和液路进行校准，使得调试后的仪器保持在最精准的状态。本次实验将使用CD4、CD25设门，在FL1和FL2的荧光通道中，使用相应鼠IgG2a染色细胞作为阴阻的分界线。仔细校对及设置各荧光通道之间的荧光补偿，然后进行对Fox P3和IL-17的检测。每管获取细胞数100 000个，用Cellquest软件进行数据分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Treg、Th17细胞检测结果比较 与健康对照组相比，慢性丙肝组外周血Treg细胞百分率明显升高（P=0.003），Th17细胞百分率明显升高（P=0.000），Treg细胞/Th17细胞明显减低（P=0.000），见表1。健康对照组Treg细胞（图1），慢性丙肝组Treg细胞（图2），健康对照组Th17细胞（图3），慢性丙肝组Th17细胞（图4）。

2.2 HCV-RNA含量和ALT与Treg细胞和Th17细胞百分率表达线性关系 HCV-RNA和ALT含量与Treg细胞和Th17细胞线性关系，见表2和3。HCV-RNA含量与Treg细胞百分率拟合曲线（图5），HCV-RNA含量与Th17细胞百分率拟合曲线（图6），ALT含量与Treg细胞百分率拟合曲线（图7），ALT含量与Th17细胞百分率拟合曲线（图8）。

3 讨论

丙肝是丙肝病毒（HCV）感染机体后，引起机体炎症反应的感染性疾病，临床表现为肝脏的急性或慢性炎症。目前全世界范围内，大约有3亿人感染或感染过HCV，85%的人群会逐渐发展为慢性肝损害，最终可能会发展成病毒性肝硬化和肝癌，这对人民身体的健康产生了严重的危害[1]。

机体在受到HCV感染后，感染初期先由机体的固有免疫应答起主要作用。在感染早期，也就是急性期，由浆细胞参与的体液免疫反应，除了接受相应抗原刺激产生相应特异性抗体，浆细胞还分泌大量细胞因子。其中，IFNβ可以诱导寡腺苷酸合成酶等而不断抑制HCV的生长，并且具有激活细胞毒性T细胞及天然杀伤性细胞等免疫活性细胞，从而起到免疫应答增强的作用[2]。由髓系树状细胞（MDC）激活的NKT细胞，也可以大量分泌IFNβ等细胞因子，进而同时增强巨噬细胞等非特异性免疫系统的功能。这些细胞因子可以增强局部炎症的反应性。所以，通常在HCV感染过后，机体固有的免疫应答不能完全将丙肝病毒从体内清除出去，这就要通过机体细胞免疫与体液免疫的免疫应答来消灭相应丙肝病毒[3-4]。

在机体中，存在一类可以调节控制体内自身免疫反应性的功能性T细胞亚群，又称调节性T细胞（Regulatory cell，Treg）。适应性调节性T细胞（aTreg或iTreg）和天然产生的自然调节性T细胞（nTreg）在人体中受到不同因素诱导产生，如CD4 Treg、NKT及Th3、Tr1等，其异常表达可能影响机体免疫自稳功能，甚至发生自身免疫性疾病[5]。

近年来，新分离一种辅助性T细胞，它可以分泌IL-17，所以又称为Th17。它与Th1和Th2的Th细胞表现不一样，特别是在分化、生物学作用等方面。例如：慢性炎性反应的介导、胞外细菌感染的防御以及自身免疫病等方面，均有突出作用。Th17细胞主要分泌的效应因子是IL-17。T细胞可以合成分泌IL-17。这一家族包含6个成员的配体（IL-17A～IL-17F）与5个受体（IL-17RA～IL-17RD和SEF）[6]。

丙肝的发病原因及机制十分复杂，无论是急性起病还是转归为慢性，其确切机制尚未完全阐明。当前比较被人们接受的观点是丙肝的发病和转归与细胞性免疫密切相关[7]。

相关研究提示，HCV感染的发生、发展过程中Treg与Th17细胞亚群以及相关细胞因子调节网络均参与其中[8]。近来也有研究发现，丙肝患者体内Treg在外周血百分含量上升，它所起的抑制作用就会增强，但是这一过程致使HCV的特异性CD8+T细胞反应性降低，进而使HCV发生持续的感染[9-10]。近幾年发现的一类新的CD4+T细胞亚群，是与调节性T细胞来源于同一前体细胞——Th17细胞，并且两者在一定条件下可以互相转化。已有研究表明：Th17细胞在感染性疾病、肿瘤中均发挥着非常重要的作用[9-12]。

关于丙肝患者Treg与Th17细胞亚群含量变化的机制尚未完全阐明。国内外研究发现HCV核心蛋白及NS3蛋白可以促进Treg与Th17细胞分化，但是转化生长因子β可以抑制其特异性Treg与Th17细胞的分化[13-15]。本研究结果显示：与健康对照组相比，慢性丙肝组的Treg与Th17细胞频率增高，Treg/Th17细胞比例降低，并且随着HCV病毒载量的上升，Treg细胞和Th17细胞百分率不断提高，与其成线性关系，与转氨酶ALT含量无关。

综上所述，丙肝发病和转归机制与Treg、Th17这两类不同的细胞亚群失去平衡密切相关。尽管Treg、Th17的免疫应答与胞内感染涉及到的防御和清除有关，但这两者的参与同时也可以导致肝组织损伤。适宜的Treg、Th17免疫应答能够有效清除HCV感染，提示可以研究出有效的免疫调节治疗方法。即通过调节Treg和Th17的平衡来清除病毒。与此同时，可以将Treg、Th17细胞亚群在机体内的含量，作为快速辅助判断丙肝患者所处感染的不同临床时期的有效证据。

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（收稿日期：2017-09-08） （本文编辑：程旭然）